Développement d’une méthode d’extraction des polyphénols du miel par SPE et caractérisation métabolomique par LC-HRMS/MS et réseaux moléculaires

Contexte scientifique

Le miel est une matrice complexe majoritairement constituée de sucres, mais contenant également une fraction mineure de métabolites secondaires issus du nectar des plantes. Parmi ces composés figurent les acides phénoliques, les flavonoïdes, les dérivés cinnamiques et d’autres métabolites bioactifs responsables de nombreuses propriétés biologiques et pouvant servir de marqueurs de l’origine botanique.

Dans le cadre du projet Prop’OMiel, la caractérisation des miels issus des forêts tropicales de La Réunion et des mangroves des Seychelles et des Comores constitue un enjeu majeur pour l’authentification des produits apicoles et la valorisation de la biodiversité régionale.

Cependant, l’analyse métabolomique du miel est fortement limitée par la présence massive de sucres qui masquent les composés d’intérêt. Une étape d’enrichissement sélectif des polyphénols est donc nécessaire avant l’analyse LC-HRMS.

Objectifs du stage

Objectif principal

Développer et valider une méthode SPE pour l’extraction sélective des polyphénols du miel avant analyse métabolomique LC-HRMS/MS.

Objectifs spécifiques

• Optimiser les conditions d’extraction des composés phénoliques
• Comparer différents sorbants SPE (C18, Oasis HLB, Strata-X, PPL)
• Évaluer les rendements d’extraction des polyphénols totaux
• Réaliser un profilage métabolomique non ciblé par LC-HRMS/MS
• Construire des réseaux moléculaires (ex : GNPS)
• Identifier des chimiomarqueurs spécifiques des miels étudiés
• Corréler les profils métaboliques avec l’origine botanique et géographique

Méthodologie

Phase 1 — Préparation des échantillons

• Dissolution du miel dans l’eau acidifiée
• Filtration et clarification
• Développement de protocoles SPE
• Élimination des sucres majoritaires
• Concentration des métabolites phénoliques

Phase 2 — Optimisation SPE

Étude de plusieurs paramètres : nature du sorbant, pH d’extraction, solvants d’élution, volumes de chargement, rendements d’extraction.

Suivi par dosage Folin-Ciocalteu, LC-UV et LC-HRMS.

Phase 3 — Métabolomique LC-HRMS

• UHPLC-HRMS Orbitrap
• Modes ESI positif et négatif
• Acquisition Full Scan et MS/MS
• Extraction des features avec MZmine 3 ou MS-DIAL

Phase 4 — Réseaux moléculaires

• Feature Based Molecular Networking (GNPS)
• Annotation via GNPS Library
• SIRIUS
• CSI:FingerID
• ISDB-DNP

Phase 5 — Traitement statistique

PCA, HCA, PLS-DA, OPLS-DA — pour l’identification des métabolites discriminants des différents terroirs.

Résultats attendus

• Développement d’un protocole SPE robuste pour les miels tropicaux
• Réduction significative des effets de matrice liés aux sucres
• Augmentation du nombre de métabolites détectés en LC-HRMS
• Construction des premiers réseaux moléculaires des miels du projet Prop’OMiel
• Identification de nouveaux chimiomarqueurs de l’origine florale
• Valorisation des données dans une base métabolomique des produits apicoles de l’Océan Indien